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Canel, Natalia Gabriela. (2016). Inyección intracitoplasmática en el bovino. Tesis para obtener el grado de Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Ciencias Agropecuarias otorgado por la Universidad de Buenos Aires. Facultad de Agronomía. Escuela para Graduados.. Recuperado de http://ri.agro.uba.ar/greenstone3/library/collection/tesis/document/2016canelnatalia
La inyección intracitoplasmática del espermatozoide (ICSI) consiste en la inyección de un espermatozoide en el citoplasma de un oocito maduro.. A diferencia de otras especies, la ICSI en bovinos produce embriones de poca calidad, con bajas tasas de blastocistos y casi nulas de desarrollo a término.. Esto podría relacionarse con: a) la descondensación incompleta del espermatozoide y b) fallas en la activación del oocito. . Para solventar el problema a) empleamos distintos pre tratamientos del semen: sexado por citometría de flujo, incubación con heparina y glutatión (Hep-GSH), doble criopreservación, y la combinación entre ellos.. Aunque todas estas estrategias facilitaron la descondensación del espermatozoide, sólo el tratamiento con Hep-GSH aumentó la producción de blastocistos, sin afectar la calidad de los mismos.. Al utilizar semen sexado, el tratamiento con Hep-GSH redujo el número de células con ADN fragmentado.. A continuación, buscamos facilitar la descondensación espermática de un modo más fisiológico.. Por un lado, los COCs fueron madurados con una concentración alta de cisteamina (1 mM) para aumentar los niveles endógenos de GSH del oocito. Además, los espermatozoides fueron incubados con COCs y se adicionó Hep directamente al medio de cultivo.. La maduración de los oocitos con cisteamina 1 mM combinada con el cultivo de espermatozoides con COCs mejoró la cantidad y la calidad de los blastocistos.. Para resolver el problema b), buscamos desarrollar nuevos protocolos de activación, utilizando drogas con un espectro de acción más específico que el de las empleadas habitualmente: roscovitina (Rosco) y PD0325901 (PD).. Nuestros ensayos muestran que Rosco produce tasas de blastocistos tan altas como las drogas de uso corriente, siendo más eficiente para inducir la extrusión del 2CP, y producir embriones con ploidía normal. El último objetivo de esta Tesis fue generar una nueva metodología que permita replicar cromosomas individuales.. Para ello, desarrollamos un protocolo para inducir la formación de micronúcleos a partir de células somáticas bovinas, y se inyectaron en oocitos enucleados.. Luego de ser activados químicamente y dividirse, se analizó el contenido nuclear de las blastómeras, y confirmamos que la maquinaria celular del oocito es capaz de replicar un bajo número de cromosomas. . En conclusión, es posible aumentar la producción de embriones de ICSI empleando semen tratado con Hep-GSH, incubando a los espermatozoides con COCs y usando cisteamina 1 mM durante la MIV, o desarrollando protocolos más adecuados de activación química.. Por otra parte, la clonación de cromosomas puede lograrse utilizando la maquinaria celular de oocitos enucleados, lo cual podría aplicarse a la transferencia de cromosomas individuales.
Canel, Natalia Gabriela. (2016). Inyección intracitoplasmática en el bovino. [Tesis de Doctorado, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Agronomía. Escuela para Graduados]. Recuperado de http://ri.agro.uba.ar/greenstone3/library/collection/tesis/document/2016canelnatalia
Canel, Natalia Gabriela. "Inyección intracitoplasmática en el bovino". (Tesis de Doctorado, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Agronomía. Escuela para Graduados, 2016), http://ri.agro.uba.ar/greenstone3/library/collection/tesis/document/2016canelnatalia